RNA 1
RNA Extraktion

RNA 2
PAGE

RNA 3
RNA Elution

RNA 4
cDNA library

RNA 5
Klonierung

Master Studiengang Anthropologie - Modul 3 - Dr. David Rosenkranz
Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) mit gesamt RNA
Abkürzunken: RT=Raumtemperatur, min=Minuten, W=Watt, V=Volt, mA=Milliampere


1.
Die PAGE Glasplatten werden zunächst mit Wasser, dann mit Isopropanol      gründlich gereinigt (fusselfreies Papier!). An beide Längsseiten und die Unterseite der großen Platte werden die entsprechenden Spacer gelegt. Die kleine Platte wird passend auf die Spacer gelegt und die beiden Platten werden mit Klammern fixiert. Die Schaumstoff Dichtungen der Spacer müssen fest an der kleinen Platte anliegen. Die Stellen an denen der Spacer der Unterseite auf die Spacer der beiden Längsseiten stößt werden mit Agarose abgedichtet.

2.
In ein Becherglas (200ml oder größer) werden folgende Reagenzien gegeben:
- 30 g Harnstoff (Urea)
- 6 ml 10x TBE Puffer
- 15 ml 40 %ige Acrylamid-Bisacrylamid      Lösung (29:1 oder 19:1)
- 10 ml H₂O

3.
Die Lösung wird auf einer Heizplatte (200 °C) unter ständigem Schwenken erhitzt bis sich der Harnstoff komplett gelöst hat. Anschließend wird die Lösung in einem 100 ml Messzylinder auf 60 ml mit H₂O aufgefüllt und wieder in das Becherglas überführt.

4.
Sobald die Lösung auf RT abgekühlt ist, werden 60µl TEMED      und 600µl 10 %iges APS      hinzupipettiert. Durch kurzes Schwenken mischen und direkt zwischen die vorbereiteten Glasplatten gießen. Anschließend den Kamm an der noch freien Oberseite einfügen.

5.
Nach ca. 20 min ist die Polymerisation abgeschlossen. Die Klammern, der untere Spacer sowie der Kamm können entfernt werden. Das untere Pufferreservoir der Gelapparatur wird mit 1x TBE Puffer aufgefüllt und das Gel in die Apparatur eingespannt. Nun kann auch das obere Reservoir mit 1x TBE Puffer aufgefüllt werden. Der Puffer sollte die Geltaschen um ca. 1 cm überlagern. Insgesamt werden etwa 800 ml 1x TBE Puffer benötigt. Das Gel muss ca. 45-60 min bei 60 W vorlaufen. Die elektrischen Eigenschaften der Polyacrylamidgele können variieren. Bei den verwendeten Spacern (Stärke ca. 1 mm) wird für eine Leistung von 60 W typischerweise eine Spannung von ca. 1200 V (bei 50mA) benötigt. Bei Anschluss mehrerer Gele ist die Wattzahl entsprechend zu erhöhen. Gele mit Spacern unterschiedlicher Stärke sollten nicht an die selbe Spannungsquelle angeschlossen werden.

6.
Nach ca. 20-30 min ist die RNA hinreichend aufgetrennt. Der zu untersuchende Gel Auschnitt wird mit einem Keil aus dem Gel gestochen, für 1 min in einer Ethidiumbromid-Lösung      (1:20000) gefärbt und anschließend für 30 sec in H₂O entfärbt. Die RNA kann nun unter einem Transilluminator sichtbar gemacht werden.



So könnte ein Gel aussehen (Beispiel aus dem Master Praktikum Sommersemester 2015):




Zuletzt aktualisiert: 11.05.2015