RNA 1
RNA Extraktion

RNA 2
PAGE

RNA 3
RNA Elution

RNA 4
cDNA library

RNA 5
Klonierung

Master Studiengang Anthropologie - Modul 3 - Dr. David Rosenkranz
Sequenzierung einer sRNA-cDNA library
Abkürzunken: RT=Raumtemperatur, U=units, h=Stunden, min=Minuten, rpm=rounds/minute, '=Minuten, ''=Sekunden


1.
Zur Aufreinigung der PCR Produktes (der cDNA library) werden Silika Säulen (QIAquick PCR Purification Kit) verwendet (alternativ kann eine Ethanol Fällung durchgeführt werden).

- Das 5-fache Volumen PB Puffer zum PCR Ansatz geben und kurz vortexen.
- Die vollständige Probe auf die QIAquick Säule auftragen.
- 1 min bei RT und 17900 g zentrifugieren.
- Durchfluss verwerfen und Säule zurück auf das Auffanggefäß setzen.
- Zum Waschen der Säule 750 µl Puffer PE auf die Säule auftragen.
- 1 min bei RT und 17900 g zentrifugieren.
- Durchfluss verwerfen und Säule zurück auf das Auffanggefäß setzen.
- Nochmals 1 min bei RT und 17900 g zentrifugieren um mögliche Rückstände des PE Puffers zu entfernen.
- Säule auf ein frisches 2 ml Tube setzen, Deckel vorher abschneiden.
- 50 µl H₂O auftragen und 1 min bei RT inkubieren.
- 1 min bei RT und 17900 g zentrifugieren. Das nun aufgereinigte PCR Produkt in ein frisches Tube umpipettieren.

2.
Das Aufgereinigte PCR Produkt kann nun in eine Vektor (Plasmid-DNA, pGEM-T von Promega) einligiert werden.
Folgende Reagenzien werden hierzu in ein 1.5 ml Tube pipettiert:

- 5µl 2x Ligationspuffer (enthält ATP)
- 3µl aufgereinigtes PCR Produkt
- 1µl pGEM-T Vektor Lösung (1:10 verdünnt)
- 1µl T4-DNA Ligase
Über Nacht bei 4 °C inkubieren.

3.
Nach erfolgter Ligation wird der Ligationsansatz aufgereinigt.

- Zum Ligationsansatz 90 µl TE Puffer und 100 µl PCI           hinzupipettieren und 1 min vortexen.
- 10 min bei 4 °C und 32000 g zentrifugieren.
- Untere (organische) Phase verwerfen, 100 µl Chloroform      hinzupipettieren und 1 min vortexen.
- 10 min bei 4 °C und 32000 g zentrifugieren.
- Untere (organische) Phase verwerfen.
- Zur verbleibenden Phase
    10 µl 3M Natriumacetat
    2 µl Glycogen (10 µg/µl)
    300 µl 100 %igen Ethanol      hinzupipettieren.
- Vortexen und 1 h bei -20 °C präzipitieren. - 1h bei 4 °C und 32000 g zentrifugieren.
- Überstand verwerfen und 300 µl 80 %igen Ethanol hinzupipettieren.
- 10 min bei 4 °C und 32000 g zentrifugieren.
- Überstand verwerfen und Pellet 5 min be RT trocknen lassen.
- Pellet in 20 µl H₂O aufnehmen.

4.
Der Aufgereinigte Ligationsansatz (enthält jetzt ausschließlich Vektor) kann nun zur Transformation via Elektroporation in elektrokompetente E. coli Zellen (TOP10) benutzt werden. Die nachfolgend aufgeführten Schritte erfolgen innerhalb eines S1 Labors.

- 50 µl E. coli-Suspension auf Eis auftauen und 6 µl Ligationsansatz hinzupipettieren.
- Ansatz in eine Elektroporationsküvette überführen.
- Elektroporationsküvette in den Elektroporator geben und Elektroporation starten.
- 1 ml Ampicillin haltiges LB-Medium zum Ansatz hinzupipettieren.
- Ansatz in ein 10 ml Kulturröhrchen geben und 1 h bei 37 °C und 180 rpm inkubieren lassen
- 50 µl des Ansatzes auf einer LB-Platte (beinhaltet Ampicillin, IPTG und X-Gal) ausstreichen.
- Platte ca. 12-18 h (über Nacht) bei 37 °C inkubieren lassen.

5.
Nachdem die einzelnen Bakterienzellen Kolonien gebildet haben, können diese Kolonien nun als Substrat für eine PCR (Taq PCR Core Kit von QIAGEN) eingesetzt werden. Pro Kolonie-PCR werden folgende Reagenzien in ein 0.5 ml PCR Tube pipettiert:

- 1 µl 10x PCR Puffer
- 0.6 µl dNTP Mix (jeweils 10 mM)
- 1 µl Primer Uni40 (100 pmol/µl)
- 1 µl Primer Rev48 (100 pmol/µl)
- 6.4 µl H₂O
Auf den Ansatz wird ein Wachs-Pellet gegeben. Dieses bei 70 °C komplett schmelzen und anschließend erstarren lassen. Dann folgende Komponenten hinzupipettieren:
- 2 µl 10x PCR Puffer
- 17.85 µl H₂O
- 0.15 µl Taq DNA Polymerase

Mit einem autoklavierten Zahnstocher eine ungefärbte Bakterienkolonie anstreichen und mit der Spitze des Zahnstochers die obere Phase des PCR Ansatzes verrühren. Dabei werden Bakterienzellen in den Ansatz überführt. Die Zellen werden bei hohen Temperaturen während der PCR aufgeschlossen und geben die Vektor-Plasmide frei die als DNA-Template für die PCR dienen. Die PCR wird entsprechend dem folgenden Program in einem Thermocycler durchgeführt: 3' 95 °C, (30'' 95 °C, 30'' 50 °C, 10'' 70°C)₃₅, 1' 70 °C.

6.
Die gewonnenen PCR Produkte können nun für die Sequenzierreaktion nach Sanger eingesetzt werden. Zunächst erfolgen jedoch enzymatische Aufreinigungsschritte um überschüssige Primer sowie nicht verbrauchte dNTPs zu eliminieren.

Zum PCR Ansatz werden 1 µl Alkaline Phosphatase 1 U/µl (z.B. SAP oder FAP von life technologies) und 0.5 µl Exonuclease I 20 U/µl (z.B. ExoI von NEB). Der Ansatz wird für 30 min bei 37 °C inkubiert und anschließend für 15 min auf 80 °C erhitzt.

Für die Sequenzierreaktion nach Sanger werden folgende Reagenzien in ein 0.5 ml PCR Tube pipettiert:

- 6 µl PCR Produkt
- 1 µl Primer (Uni40 ODER rev48)
- 1 µl H₂O
- 1.6 µl Sequenzierungs Puffer (BigDye Premix)
- 0.4 µl BigDye
Der Ansatz durchläuft im Thermocycler folgendes Program: (10'' 95 °C, 4' 55 °C)₃₀.

Nach erfolgter Sequenzierreaktion wird der Ansatz mit 1 µl 0.22 %igem SDS           versetzt und für 5 min auf 98 °C erhitzt. Anschließend erfolgt eine finale Aufreinigung mit Sephadex G-50 fine.

- Sephadex mithilfe einer Matrixplatte in eine Sequenzaufreinigungs (SA-) Platte geben.
- 300 µl H₂O auf die Säulchen pipettieren und 2.5 h bei 4 °C quellen lassen.
- SA-Platte auf einer 96er Zellkultur Platte befestigen und 3 min bei 4 °C und 1300 g zentrifugieren.
- 150 µl H₂O auf die Säulchen pipettieren und 3 min bei 4 °C und 1300 g zentrifugieren.
- 96er Zellkultur Platte gegen eine 96er PCR Platte austauschen.
- Sequenzieransatz mittig auf die Säulchen pipettieren.
- 5 min bei 4 °C und 1300 g zentrifugieren.
- 5 µl Hi-Di Formamid      auf die aufgereinigten Proben pipettieren.
- PCR Platte mit Septum verschließen und 3 min bei 95 °C im Thermocycler denaturieren.

Die Proben können nun in einem Kapillarsequenzierer (ABI 3130xl) sequenziert werden.




Zuletzt aktualisiert: 13.05.2016