RNA 1
RNA Extraktion

RNA 2
PAGE

RNA 3
RNA Elution

RNA 4
cDNA library

RNA 5
Klonierung

Master Studiengang Anthropologie - Modul 3 - Dr. David Rosenkranz
Herstellung einer sRNA-cDNA library
Abkürzunken: RT=Raumtemperatur, min=Minuten, M=molar, mM=millimolar, pmol=picomol, U=units, '=Minuten, ''=Sekunden


Die hier beschriebene Methode zur Herstellung einer sRNA-cDNA library stellt eine modifizierte und auf 4 Stunden verkürzte (quick-and-dirty) Version gängiger Laborprotokolle dar.

1.
Zur 3' Polyadenylierung werden folgende Reagenzien in ein 1.5 ml Tube pipettiert:
- 22 µl RNA-Lösung
- 3 µl 10x A-Plus Poly(A) Polymerase Puffer
- 1.5 µl A-Plus Poly(A) Polymerase
- 3 µl 10 mM ribo-ATP
- 0.5 µl RiboLock (40 U/µl)
15 min bei 37 °C inkubieren.

2.
Die Polyadenylierte RNA muss für die Ligation des 5' Linkers aufgereinigt (gefällt/präzipitiert) werden. Hierzu werden folgende Reagenzien zum Polyadenylierungs-Ansatz hinzupipettiert:
- 90 µl 100 %iger Ethanol      (-20 °C)
- 8.5 µl 3 M Natriumacetat (200 mM Endkonzentration)
- 1.5 µl Glycogen (10 µg/µl)
Nach kurzem vortexen wird die RNA für 15 min bei -20 °C präzipitiert und anschließend bei 4 °C und 16000 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird sauber abpipettiert und das RNA Pellet in 34 µl H₂O aufgenommen.

3.
Für die Ligation des RNA-Linkers werden folgende Reagenzien zur RNA-Lösung hinzu pipettiert:
- 5 µl 10 mM ribo-ATP
- 3 µl RNA-Linker
- 2 µl T4 RNA Ligase
- 5 µl 10x T4 RNA Ligase Puffer
30 min bei 37 °C inkubieren.

4.
Für die cDNA Synthese muss die RNA aufgereinigt (gefällt/präzipitiert) werden. Hierzu werden folgende Reagenzien zum Ligations-Ansatz hinzupipettiert:
- 150 µl 100 %iger Ethanol      (-20 °C)
- 14.5 µl 3 M Natriumacetat (200 mM Endkonzentration)
- 2 µl Glycogen (10 µg/µl)
Nach kurzem vortexen wird die RNA für 15 min bei -20 °C präzipitiert und anschließend bei 4 °C und 16000 g für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wird sauber abpipettiert und das RNA Pellet in 11 µl H₂O aufgenommen.

5.
Für die cDNA Synthese (reverse Transkription, RT) werden zunächst folgende Reagenzien zur RNA-Lösung hinzu pipettiert:
- 1µl RT-Primer (10 pmol/µl, hausinterne Oligo-Nr.: 893)
- 1 µl dNTP Mix (jeweils 10 mM)

Für 5 min auf 65 °C erhitzen, dann auf Eis abkühlen lassen. Anschließend folgende Reagenzien hinzu pipettieren:
- 4 µl 5x SuperScript III RT Puffer (First Strand Buffer)
- 1 µl DTT (0.1 M)     
- 1 µl RiboLock (40 U/µl)
- 1 µl SuperScript III RT

Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen, den Reaktionsansatz in ein 0.5 ml Tube überführen und für folgendes Programm in den Thermocycler geben:
- 50 °C für 30 min
- 70 °C für 15 min
- 4 °C bis zur weiteren Verwendung
  

6.
Es wird eine PCR entsprechend des ausgeteilten Protokolls durchgeführt. Folgende Primer werden eingesetzt:
- GACTGGAGCACGAGGACACTGA (hausinterne Oligo-Nr.: 894)
- CGAATTCTAGAGCTCGAGGCAGG (hausinterne Oligo-Nr.: 895)
Programm für den Thermocycler: 3' 95 °C, (30'' 95 °C, 30'' 50 °C, 10'' 70°C)₃₅, 1' 70 °C.

Das resultierende PCR Produkt stellt eine cDNA library dar. Alle Moleküle besitzen identische 5' bzw. 3' Sequenzen. Sie unterscheiden sich jedoch durch den Abschnitt der der aus dem Polyacrylamidgel eluierten und eingesetzten RNA entspricht. Für eine Sanger-Sequenzierung müssen die Moleküle daher zunächst durch Ligation in ein Vektor-Plasmid und anschließende Transformation in E.coli Zellen (Klonierung) vereinzelt werden.


Zuletzt aktualisiert: 06.05.2016